Citometria de fluxo: aplicações, vantagens e desvantagens
A citometria de fluxo é um assunto temido pelos alunos pois parece ser muito complexo, mas, não é tanto assim. Esse artigo te ajudará a sanar algumas dúvidas que sempre ficam e te mostrará que o assunto é mais simples do que você imagina. Neste artigo iremos responder as seguintes questões:
1) O que é Citometria de Fluxo?
2) Quais os princípios básicos da citometria de fluxo?
3) O que é imunofenotipagem por citometria de fluxo?
4) Como é feita a citometria de fluxo?
5) Quais as aplicações da citometria de fluxo no laboratório clínico e de pesquisa?
6) Quais as vantagens e desvantagens da citometria de fluxo comparada aos outros
métodos de análise?
7) Como interpretar os resultados da citometria de fluxo?
Boa leitura!
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O que é a citometria de fluxo?
A primeira pergunta e a mais importante a ser respondida é: O que é a citometria de fluxo? A citometria de fluxo é um método utilizado para o estudo de partículas, que podem ser células, componentes celulares ou até material não-celular, suspensas em meio líquido em fluxo e marcadas com fluorocromos ou anticorpos monoclonais acoplados a fluorocromos através de medidas de dispersão de luz. Essa técnica permite a análise de diversos parâmetros simultaneamente, por isso também é chamada de citometria de fluxo multiparamétrica.
Quais os princípios básicos da citometria de fluxo?
Sucintamente, a citometria de fluxo acontece após as células passarem uma a uma na frente de um ou mais lasers, que geram sinais luminosos captados e convertidos em sinais elétricos, e estes são convertidos em dados eletrônicos que são absorvidos pelo software e resultam nas informações programadas previamente para serem pesquisadas.
Como é realizada essa técnica, passo-a-passo?
Abaixo vamos descrever a metodologia basicamente em alguns passos:
1) Células em suspensão são interceptadas uma a uma pelo laser, orientadas em fluxo laminar (como uma fila indiana);
2) Um detector é apontado na linha do feixe de laser e outros vários são apontados perpendicularmente a este, além de detectores fluorescentes que também são utilizados;
3) Cada partícula, ao passar pelo laser, dispersa luz de uma forma, e os fluorocromos fluorescentes da partícula podem emitir luz de menor frequência do que a fonte;
4) Os detectores captam esses sinais luminosos emitidos pelas partículas, melhoram-nos e analisando as flutuações de brilho de cada detector tem-se as informações obtidas através de sinais eletrônicos que são transmitidos ao computador.
Então, a citometria de fluxo só exige de alguém a fase pré-analítica, que é a preparação da suspensão de células, e a fase pós-analítica, que é a interpretação dos resultados. A técnica em si é toda realizada no interior do equipamento, o citômetro, porém é muito aplicada e necessária em diversas áreas, clínicas e de pesquisa.
Diversas amostras podem ser pesquisadas, como sangue periférico, cultivo celular, medula óssea, tecido, líquor e até mesmo amostras sólidas, como fragmentos do fígado e de tumores. A única exigência é de que essas amostras estejam em uma suspensão, e em todo caso, as células devem ser dissociadas de forma que evite a formação de grumos.
Figura 1: Citômetro e seus sistemas (fonte: Importância da citometria de fluxo no diagnóstico diferencial das leucemias. Revista UNILUS Ensino e Pesquisa v.5, n.8, jan./jun.2008).
Quais as aplicações da citometria de fluxo no laboratório clínico e de pesquisa ?
As principais aplicações desse método em um laboratório, seja ele clínico ou de pesquisa, é na fenotipagem dos leucócitos, fenotipagem de células tumorais (primordial no diagnóstico de patologia onco-hematológicas), na análise de DNA, análise da função dos neutrófilos, na contagem de reticulócitos (que é uma das aplicações mais utilizadas), detecção de disfunção plaquetária, quantificação de “stem-cell”, monitoramento de quimioterapia e resultados de tratamentos, entre outras inúmeras aplicações um pouco menos utilizadas.
A hematologia é um setor que se beneficia completamente da citometria, principalmente com a imunofenotipagem, pois estuda diretamente as células. Então utiliza desde o diagnóstico e investigação da patologia, até à resposta do tratamento.
A citometria de fluxo tem inúmeras aplicações, como pode-se ver, e algumas delas são bem curiosas, como a utilização da técnica da oceanografia (que é usada para contar as diferentes populações de Picoplanctons fotossintéticas com base fluorescência de pigmentos próximos à clorofila) e na análise de cromossomos, na fisiologia vegetal, na produção de cálcio e diversas outras.
O que é imunofenotipagem por citometria de fluxo?
É uma metodologia fundamental para o diagnóstico de doenças onco-hematológicas, suas origens e estágio, e indispensável em outras análises também, que consiste na análise do perfil imunológico da célula, ou seja, a linhagem e seu estágio de diferenciação e maturação, a partir da caracterização dos antígenos de superfície, citoplasma ou núcleo com os anticorpos monoclonais marcados. Com isso, a imunofenotipagem pode diferenciar as células normais de células anômalas, e definir o imunofenótipo e seu percentual na amostra analisada. E essa é uma das vantagens da citometria de fluxo.
Quais são as vantagens e desvantagens da citometria de fluxo comparadas às outras análises?
A principal vantagem é que é uma técnica que permite analisar diversas células e em diversos parâmetros ao mesmo tempo e consegue analisar antígenos marcados em superfície, citoplasma e núcleo. E tem como desvantagem ter um equipamento de alto custo, ter uma baixa vazão celular, causar a morte de muitas células da amostra e também pela necessidade de células em suspensão, que em alguns materiais necessita de uma preparação mais difícil ou às vezes impossível. Mas também se tem a vantagem de ser automatizado e de disponibilizar os resultados no computador.
O equipamento utilizado na citometria de fluxo, o citômetro de fluxo, é muito semelhante ao microscópio porém ao invés de “produzir” imagens, produz uma quantificação de uma conjunção de vários parâmetros, e é composto apenas de uma célula de fluxo (por onde passam as células uma a uma), uma fonte de luz, um sistema óptico / eletrônico composto de filtros e detectores e um computador para os resultados. E este equipamento tem um custo mais alto devido, principalmente, ao software que o acompanha.
Como interpretar os resultados da citometria de fluxo?
Os dados obtidos são interpretados com base no ângulo dos feixes de luz emitidos pelas células e são compilados em gráficos onde o eixo X corresponde à intensidade do espalhamento frontal (chamado de FSC) e o eixo Y corresponde ao espalhamento lateral (chamado de SSC) do feixe de luz.
O FSC emite informações quanto ao tamanho da célula e o SSC quanto à quantidade e densidade dos grânulos da célula.
Para refinar e identificar sequencialmente as populações celulares em pesquisa tem-se um método chamado “gating” que utiliza marcados moleculares.
Todo resultado é compilado e convertido em dados eletrônicos em um software e disponibilizado para visualização no computador.
Fonte: MODESTO, Thaís M. et al. Importância e vantagem da citometria de fluxo frente aos testes de triagem no diagnóstico da hemoglobinúria paroxística noturna. Rev. Bras. Hematol. Hemoter., São José do Rio Preto , v. 28, n. 4, p. 275-279, Dec. 2006 .
Referências
http://www.cdg.org.br/especialidades/imunofenotipagem
http://www.conhecer.org.br/enciclop/2016a/agrarias/citometria.pdf
http://www.diagnosticosdobrasil.com.br/material-tecnico/citometria-de-fluxo-lamina
http://www.icb.usp.br/~imunoicb/?page_id=295
http://www.sbpc.org.br/upload/congressos/_Aplicacoes_da_citometria_de_fluxo_no_diagnostico_onco-hematologico.pdf
Pt.slideshare.net/rwportela1/icsa17-imunologia-prtica-citrometria-de-fluxo
Autora
Júlia Scandalo
Biomédica Especialista em Biomedicina Estética
