Imunofluorescência direta e indireta: conheça as diferenças, aplicações, vantagens e desvantagens
A técnica de imunofluorescência iniciou-se em 1942 quando Albert Coons e col. aplicaram pela primeira vez a técnica utilizando a imunofluorescência direta em tecido de pulmão para demostrar a marcação de anti-anticorpos de pneumococos com fluoresceína. A imunofluorescência é muito aplicada na histologia e na sorologia utilizando-se marcadores fluorescentes que podem ser visualizados no microscópio de fluorescência UV. Na década de 60 iniciou-se a utilização desta técnica na Dermatologia para estudos de diversas patologias de pele. Em muitos laboratórios de Histopatologia biópsias de rim e de pele são examinadas com técnicas de imunofluorescência para diferenciação de tumores com técnicas imunoenzimáticas para observação em microscopia de luz.
1) O que é imunofluorescência?
A imunofluorescência é uma metodologia baseada em uma marcação pelos antígenos utilizados tanto nos tecidos quanto em soro humano ou animal, e assim por meio de anticorpos específicos, marcados com fluorocromos, onde essas substâncias são capazes de absorverem a luz ultravioleta (UV), emitindo-a num determinado comprimento de onda, e assim permitindo sua observação ao microscópio de fluorescência (com luz UV), com isso podemos identificar e diagnosticar precisamente sua presença pela sua fluorescência.
Os fluorocromos mais utilizados: Fluoresceína (FITC fluoresceína isocianetada) e Rodamina (TRICT).
O microscópio de epi fluorescência é utilizado e uma reação imunofluorescente é desencadeada no microscópio de epi fluorescência, ocorrendo após a emissão de luz de cor quando o fóton é excitado por luz de curto comprimento de onda (Figura 1).
Figura 1 – Microscópio de epi fluorescência https://pt.wikipedia.org/wiki/Microscopia_de_fluoresc%C3%AAncia
Existem dois tipos de imunofluorescência:
• Imunofluorescência direta;
• Imunofluorescência Indireta.
2) Como funciona a imunofluorescência?
Na técnica de imunofluorescência são utilizados os fluoróforos ou fluorocromos que serão estimulados por um determinado comprimento de onda, emitindo fótons de luz fluorescentes, de acordo com o protocolo a ser seguido no exame. Essa técnica pode ser realizada tanto em tecidos como em soro. Para cada exame um protocolo definido deve ser seguido para visualização dos marcadores, que serão adicionados a amostra do paciente. Os fluorocromos são corantes que absorvem radiação (luz ultravioleta), são por ela excitados e emitem luz visível, coloração verde, azul ou vermelha dependendo do estímulo e enzimas utilizados na reação. Para que funcionem como marcadores, necessitam possuir grupos químicos capazes de formar ligações covalentes com moléculas proteicas, emitindo alta fluorescência no espectro visível com coloração distinta da emitida pelos tecidos e podemos visualizá-las no microscópio.
3) Para que serve o teste de imunofluorescência?
A técnica de imunofluorescência serve para diagnóstico de doenças tanto em humanos como em animais. Doenças dermatológicas como dermatites, pênfigos, lúpus, líquen, dermatoses, colagenases, no diagnóstico de sífilis, de autoanticorpos autoimunes, detecção direta de microrganismos como bactérias, parasitas, em secreções como urina, fezes, cortes histológicos de tecidos (tumores) e investigação de parasitoses e doenças envolvendo a medicina veterinária.
4) O que é reação de imunofluorescência direta?
Na imunofluorescência direta detecta-se o antígeno pesquisado propriamente dito utilizando os marcadores fixados com fluorocromos.
5) O que é reação de Imunofluorescência indireta?
A imunofluorescência indireta baseia-se no princípio de uma dupla camada, é utilizada na detecção de anticorpos por antígenos impregnados em uma lâmina, onde se aplica primeiramente um anticorpo específico não fluorescente. Por fim, coloca-se um anticorpo fluorescente com especificidade marcada contra determinados antígenos do primeiro anticorpo usado para reagir com o antígeno (Figura 2).
Figura 2 – Tipos de reação de imunofluorescência (fonte: https://pt.slideshare.net/yulimaia/imunofluorescencia-14884561?next_slideshow=1).
6) Quais as diferenças, vantagens e desvantagens entre o teste de imunofluorescência direta e indireta?
Vantagens
• Possibilita uma ótima fluorescência;
• Permite-se trabalhar com vários anticorpos primários específicos para vários sítios de antígenos, sendo eficaz na identificação ao qual o anticorpo pertence, abrangendo o campo de diagnóstico mais preciso.
• Ambas possuem uma grande sensibilidade ao teste, e não demandam muito tempo de realização; Especificidade, reprodutibilidade, simples padronização, são capazes de localizar antígenos intra e extracelulares.
Desvantagens
Está na intensidade dos fluorocromos que às vezes dificultam o diagnóstico, a metodologia é cara e o custo da manutenção dos aparelhos e do microscópio é alta, a técnica é realizada manualmente podendo ocasionar erros e subjetividade na leitura.
Diferenças
A imunofluorescência direta é mais simples que a indireta e mais barata, mas dependendo do diagnóstico a ser feito e o material, escolhe-se a indireta pela possiblidade de diagnóstico mais preciso. A Imunofluorescência direta é mais utilizada em histologia e a Imunofluorescência indireta mais em sorologia em humanos e animais.
7) Como é feito o teste de imunofluorescência (passo a passo)?
Imunofluorescência Direta é uma técnica mais simples. As etapas do procedimento são:
1. Confecção do material na lâmina;
2. Fixação com anticorpos escolhidos;
3. Incubação;
4. Lava-se a lâmina removendo excesso de anticorpos marcados não ligados;
5. Visualização no microscópio (lembrando: sempre microscópio Uv nunca microscópio convencional).
Na imunofluorescência indireta a placa de fluorescência já vem com os antígenos específicos sem fluorocromos, testa-se o soro do paciente e depois adiciona-se um anti-anticorpo marcado com fluorocromo, dizemos que essa técnica é de camada dupla pois há uma dupla camada de ligação de antígenos e anticorpos para ligar-se e emitir a fluorescência para ser medida pelo comprimento de onda.
Etapas da técnica de imunofluorescência indireta
1. Existem protocolos de Antígenos que são escolhidos de acordo com o material a ser analisado onde são fixadas a lâminas de vidro para posteriormente adicionarmos o material;
2. Realiza-se a diluição do soro teste, colocando-o sobre o antígeno e incubando-o para que possa formar o complexo antígeno-anticorpo.
3. Na etapa seguinte são feitas várias lavagens para a retirada dos anticorpos que não foram ligados na reação.
4. Toda a reação é incubada com o marcador fluorescente e, se houver anticorpo no soro, o marcador reage com o anticorpo específico para o antígeno.
5. Antígeno específico + Marcador fluoresceinado → Observa-se a reação no microscópio.
6. Anticorpo pesquisado visualizado para leitura.
Considerações finais
A imunofluorescência ainda está sendo utilizada na rotina laboratorial, mas estão sendo gradativamente substituídas por outros testes como imunoenzimáticos, principalmente devido à necessidade de microscopia manual, subjetividade de leitura, alto custo de operação e dificuldade de automação.
Figura 3 – Imunofluorescência Direta feita em tecido, padrão ouro em diagnóstico direto (fonte: Instituto de Nefropatologia).
Figura 4 – Imagem de pele Peri lesionada (fonte: Blog Euroimmun Brasil).
Figura 5 – Imunofluorescência indireta em células Hep-2 testadas com soro (fonte: Google).
Figura 6 – Imunofluorescência indireta para diagnóstico de neosporose (fonte: Instituto de Investigações parasitárias da Faculdade Anclivepa de Medicina Veterinária).
Referências Bibliográficas
Anais Brasileira de Dermatologia Vol. 81, (2) – Rio de janeiro – Março/ Abril de 2006.
Aoki V, Sousa JX Jr, Fukumori LM, Perigo AM, Freitas EL, Oliveira ZNP. Imunofluorescência direta e indireta. An Bras Dermatol. 2010;85(4):490-500.
http://dx.doi.org/10.1590/50365-05962006000200002.
http://nefropatologia.com.br/servico/imunofluorescencia-direta/.
http://pt.wikipedia.org/wiki/Imunofluoresc%C3%AAncia.
http://www.infoescola.com/exames-medicos/imunofluorescencia.
http://www.microrao.com/micronotes/immunofluorescence.pdf.
http://www.portaleducacao.com.br/farmacia/artigos/6971/imunofluorescencia.
https://www.euroimmun.com.br/blog/166/Microscopio-EUROPattern-da-EUROIMMUN-agora-disponivel-para-leitura-de-tecidos-EUROIMMUN-Brasil.
https:www.passeidireto.com/arquivo/47871658/imunoflurescencia-slide.
Revista Brasileira de Veterinária – 2012/2013 – Volume 19.
SlideShare – UNIVERSIDADE FEDERAL DA BAHIA INSTITUTO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE – ICS DEPARTAMENTO DE BIOINTERAÇÃO DISCIPLINA: IMUNOLOGIA I – ICS 045 IMUNOFLUORESCÊNCIA – Aretha Alves Borges da Silva, Roberto Meyer, Claudia Brodskin e Ricardo Portela. Fevereiro de 2010.
Autora
Anjuly Moura da Silva
Biomédica, Especialista em Imuno-hematologia, MAB em Auditoria em Saúde.
