Imuno-histoquímica: o que é esse exame, como é feito e para que serve?
Imuno-histoquímica: o que é esse exame, como é feito e para que serve? Nesse texto vamos explicar o que é o exame de imuno-histoquímica, como ele é feito e para que ele serve.
Iremos responder as seguintes questões neste artigo:
1. O que é exame de imuno-histoquímica?
2. Como é feito um exame imuno-histoquímico?
3. Para que serve o exame de imuno-histoquímica?
4. Qual a aplicabilidade da imunohistoquímica no diagnóstico das neoplasias?
Boa leitura!
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Introdução à imuno-histoquímica
Imagine que você, um biomédico, é escalado para a detecção de um tipo específico de célula em uma amostra de um paciente. A partir da identificação deste tipo celular será possível a escolha da melhor estratégia para o tratamento deste paciente. Entretanto, pelos meios convencionais de microscopia, não é tão fácil diferenciar os tipos celulares, especialmente nos casos de tecidos pouco diferenciados. Então, como você resolveria este problema?
Para isso, a imuno-histoquímica (IHQ) foi desenvolvida como um método de detecção de diferentes alvos teciduais utilizando-se de uma estratégia semelhante à do sistema imunológico. Anticorpos (responsáveis pela detecção dos alvos, ou antígenos teciduais), demarcam os alvos moleculares em amostras teciduais, o que permite a localização e quantificação destes. Utilizada tanto em meio clínico quanto em meio experimental, a IHQ diferencia os tipos celulares, ou outros organismos, a partir dos antígenos teciduais, também denominados marcadores teciduais. Como uma espécie de etiquetas celulares, os marcadores teciduais estão associados à presença deste tipo celular na amostra analisada. Desta forma, os anticorpos empregados na IHQ são desenvolvidos em laboratórios para reconhecer especialmente estes marcadores.
Legenda: A técnica de IHQ é amplamente utilizada tanto em ambiente experimental quanto clínico. Na primeira imagem, anticorpos fluorescentes na frequência do vermelho ressaltam o marcador citoqueratina 18 em tecido de carcinoma de colón. Ainda, foi utilizado um anticorpo fluorescente na frequência do azul para demarcar os núcleos celulares. Na segunda imagem, anticorpos conjugados a peroxidase demarcam a proteína p21 em carcinoma de pulmão (fonte: https://www.thermofisher.com/br/en/home/life-science/protein-biology/protein-biology-learning-center/protein-biology-resource-library/pierce-protein-methods/overview-immunohistochemistry.html).
1. O que é o exame de imuno-histoquímica?
O exame de imuno-histoquímica (IHQ) emprega esta técnica para a composição do diagnóstico de um paciente. Diferentes tipos de amostras (sangue ou fragmentos teciduais, por exemplo) podem ser submetidas à IHQ, procurando-se pelos marcadores relacionados com as suspeitas clínicas. As amostras coletadas são submetidas a protocolos de IHQ (os quais serão discutidos adiante) com anticorpos conjugados a enzimas (as quais catalisam reações colorimétricas, como a peroxidase) ou a fluoróforos, os quais emitem um sinal fluorescente que pode ser detectado (fluoresceína ou rodamina emitem fluorescência na frequência do verde ou vermelho, respectivamente). Desta maneira, os anticorpos empregados permitem a localização e identificação dos marcadores nas amostras, permitindo diversas aplicações no diagnóstico de doenças inflamatórias, infecciosas e neoplásicas.
2. Como é feito um exame imuno-histoquímico?
Apesar das variações entre protocolos, os exames de imuno-histoquímica seguem etapas em comum:
– Coleta das amostras
As amostras são obtidas por biópsia, cirurgia ou punção. O tipo de amostra varia conforme a patologia a ser examinada, sendo o sangue ou fragmentos teciduais os mais usuais. É importante notar que a qualidade da coleta das amostras correlaciona-se diretamente com a qualidade do exame em geral. Assim, devem ser protegidas da luz, umidade e fontes de calor assim que coletadas. Amostras de fragmentos sólidos devem ser condicionadas em solução fixadora, como a solução formalina ou o formaldeído. A solução fixadora preserva o tecido coletado até a análise da amostra.
– Processamento – Fixação e preparação
Em sequência, as amostras são parafinizadas e submetidas a um protocolo histológico muito semelhante ao utilizado em outras colorações, como hematoxilina e eosina. Entretanto, etapas de bloqueio de enzimas do tecido e de recuperação antigênica são necessárias a depender do método empregado na fixação. A etapa de recuperação antigênica aumenta o poder de ligação dos anticorpos ao recuperar parte das alterações moleculares provocadas pelos fixadores na amostra.
– Processamento – Coloração e Marcação de Antígenos
Em seguida, as lâminas são incubadas em soluções com os anticorpos para os marcadores da patologia a ser estudada. Frequentemente emprega-se uma contra coloração para comparação e referencial durante a investigação da lâmina.
Os métodos de IHQ se diferenciam de acordo com o tipo de anticorpo empregado. O método direto utiliza apenas um anticorpo, o qual possui uma porção que se conecta com o marcador tecidual e outra porção sinalizadora (frequentemente fluorescente). O método indireto, por sua vez, utiliza duas camadas de anticorpos. Os anticorpos da primeira camada são chamados de primários e conectam-se ao marcador tecidual. Os anticorpos secundários, compondo a segunda camada, contém uma porção sinalizadora e ligam-se aos anticorpos primários. O método indireto possui maior sensibilidade, dado que mais de um anticorpo secundário pode ligar-se a um anticorpo primário. Um esquema visual pode ser conferido na imagem 2.
– Quantificação
Na quantificação dos exames frequentemente empregam-se métodos colorimétricos e fluorescentes. Os métodos colorimétricos possuem produtos com tom castanho na lâmina nos sítios de ligação dos anticorpos (nos casos de anticorpos conjugados com a enzima peroxidase). A marcação de anticorpos fluorescentes é analisada pela fluorescência emitida. Como a maioria dos exames leva em consideração aspectos qualitativos (presença ou não), a quantificação nem sempre é feita. Alguns fatores, como a espécie de fixador, podem interferir nos resultados do exame, por isto, os cuidados durante o processamento e quantificação devem ser muito bem conhecidos pelo profissional biomédico.
Legenda: Esquema representativo dos possíveis métodos empregados na IHQ. O método direto considera o uso de anticorpos os quais possuem uma porção fluorescente, a qual está diretamente conectada à porção que reconhece o marcador celular. Ainda, o método indireto pode ser desempenhado a partir de duas camadas de anticorpos: a primária, a qual se conecta diretamente aos marcadores celulares e a secundária, que pode ser formada por anticorpos que reconhecem o anticorpo primário, ligando-se a este diretamente, ou então, pode ser formada por anticorpos secundários que conectam-se aos anticorpos primários a partir da proteína A. De toda forma, reconhece-se que o método indireto frequentemente apresenta maior sensibilidade, uma vez que mais de um anticorpo secundário pode conectar-se aos anticorpos primários (fonte: https://www.sobrau.com/wp-content/uploads/2016/11/Testes-Laboratoriais-Aplicados-Imunologia-Clinica.pdf).
3. Para que serve o exame de imuno-histoquímica?
A função dos exames de imuno-histoquímica (IHQ) é auxiliar no diagnóstico de diferentes patologias. Este exame permite procurar por fatores preditivos e prognósticos de pacientes oncológicos; facilita a determinação da natureza (benigna ou maligna) de neoplasias; assume papel importante no diagnóstico de tumores indiferenciados e pode também ser aplicado na identificação de agentes infecciosos, principalmente virais.
Desta maneira, o exame de IHQ participa da confirmação de infecções, principalmente pela pesquisa dos vírus da hepatite B e C. Além disto, a IHQ pode ser aplicada em amostras não necessariamente fixadas. Um dos exemplos é a aplicação desta técnica no escarro de pacientes imunocomprometidos na pesquisa por pneumocistos, permitindo a rápida confirmação da infecção para o início do tratamento adequado.
4. Qual a aplicabilidade da imuno-histoquímica no diagnóstico das neoplasias?
Uma das mais frequentes aplicações do exame de imuno-histoquímica (IHQ) é justamente auxiliar de diferentes maneiras o diagnóstico de neoplasias. Ao recordamos a definição de neoplasia, podemos definir como “um distúrbio do crescimento celular desencadeado por uma série de mutações adquiridas as quais afetam um tipo celular e toda a progênie clonal”. Em última instância, uma neoplasia é caracterizada por uma proliferação excessiva das células que é independente dos sinais de crescimento fisiológico do tecido. Neste caso, englobam-se os tumores.
A nomenclatura frequentemente utilizada designa este crescimento celular excessivo de tumor, podendo ser classificado como benignos ou malignos – neste último caso, também chamados de cânceres – a depender das características morfológicas e histológicas observadas microscopicamente. Neste caso a IHQ pode ser útil para a diferenciação entre tumores benignos e malignos. Exemplos de marcadores considerados neste caso são: CA 15-3, MCA, CA 125 e CA-19-9. Vale lembrar que cada neoplasia possui um marcador tecidual específico a ser considerado nos exames de IHQ.
Dentro da diferenciação entre os tipos de neoplasia, procura-se por marcadores a fim de predizer também as chances de resposta a um determinado tratamento. Um exemplo disto é a utilização da IHQ no prognóstico de pacientes de câncer de mama ou de próstata, utilizando-se como marcadores os receptores de estrogênio-progesterona e testosterona, respectivamente.
Uma outra categoria de cânceres, os linfomas – neoplasias que acometem células linfáticas, em linhas gerais – podem ser descritos também a partir de exames de IHQ. Os marcadores PAX5/Pax5 e MUM1/IRF4, OCT2 e BOB1 são utilizados como marcadores para os diferentes tipos de linfoma e como diagnóstico diferencial entre estes. Um outro tipo de neoplasia denominada anaplasia, caracterizada pela grande taxa de mitose das células e torna o tecido totalmente indiferenciado. Desta maneira, o tecido passa a não expressar determinados marcadores e assim, também pode-se utilizar exames de IHQ para a diferenciação. Ainda, uma outra aplicação da IHQ é no reconhecimento da origem celular, a fim de indicar a ocorrência de metástase, por exemplo.
Legenda: A IHQ na diferenciação celular no linfoma de células T anaplásico. No painel A, verifica-se a presença de células atípicas e linfócitos, de maneira não diferenciada. Com as demarcações de CD30þ no painel B, CD4þ no painel C e das células tumorais que apresentam a quinase de linfoma anaplásico (CD246) no painel D, diferencia-se o tipo celular da amostra, exatamente como foi perguntado no início do texto (aumento original 600x) (fonte: https://www.archivesofpathology.org/doi/pdf/10.5858/arpa.2016-0518-RA).
Resumo e Conclusões
A imuno-histoquímica (IHQ) é uma técnica amplamente utilizada tanto em ambiente de pesquisa quanto em ambiente clínico. A técnica baseia-se na interação antígeno-anticorpo, entretanto, com a aplicação de anticorpos produzidos industrialmente, os quais reagem com marcadores moleculares específicos de cada patologia. Estes marcadores moleculares podem ser proteínas ou carboidratos presentes na amostra, caracterizados na patologia, podendo ser receptores na membrana celular, enzimas ou proteínas intracelulares com inúmeras funções.
Dentre as aplicações da IHQ, destacam-se os exames de IHQ para o reconhecimento de patógenos, como diferentes microrganismos, ou então, tipos celulares específicos, os quais são responsáveis pela dinâmica tecidual da patologia com a qual o paciente se encontra. Um exemplo disto é o exame de IHQ no diagnóstico de neoplasias, os tumores. Os exames de IHQ são aplicados de acordo com as suspeitas, sendo o resultado componente de todo o diagnóstico. Assim, podemos afirmar que o exame de IHQ participa do diagnóstico de neoplasias e facilita a adoção da melhor estratégia de tratamento para os pacientes.
Referências
http://www.patologiaphd.com.br/2018/imuno-histoquimica-uma-ferramenta-poderosa-para-a-investigacao-do-tecido-e-diagnostico-anatomopatologico/.
http://www.rpm.fmrp.usp.br/kit/Manual_de_Imuno-histoquimica.pdf.
http://www.tecsa.com.br/assets/pdfs/IMUNO-HISTOQU%C3%8DMICA%20DE%20NEOPLASIAS.pdf.
https://www.archivesofpathology.org/doi/full/10.5858/arpa.2016-0518-RA.
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2832341.
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3439132/.
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3467869/.
https://www.scielo.br/pdf/jbpml/v41n5/a11v41n5.pdf.
https://www.scielo.br/pdf/jbpml/v42n2/a12v42n2.pdf.
https://www.scielo.br/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0100-69912002000200009.
https://www.scielo.br/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0100-69912012000200002.
Autor
Leonardo André da Costa Marques – Biomédico, Mestre em Farmacologia
